ADN RECOMBINANTE EN LA NATURALEZA DEL CÁNCER GÁSTRICO

Clonaje y expresión heteróloga de un fragmento de la proteína CagA de Helicobacter pylori

 Numerosos estudios confirman que la infección con cepas de Helicobacter pylori CagA-positivas aparece asociada al desarrollo de patologías gastroduodenales más severas, es por ello que la detección de anticuerpos anti-CagA adquiere una importancia significativa en la detección serológica de la infección con H. pylori. Este estudio fue llevado a cabo con el objetivo de expresar un fragmento recombinante de la proteína CagA con una cola de histidina (rCagA) que pueda ser empleado en un juego serológico rápido para detectar la infección con H. pylori y clasificar la misma en CagA-positiva o negativa.
Para ello  se toma un fragmento del gen cagA procedente de la cepa de H. pylori 17874 que fue amplificado por PCR. Éste fue clonado en el vector de expresión pET22b(+) y esta construcción empleada para transformar la cepa de E.coli BL21 (DE3) y expresar el fragmento recombinante rCagA. La técnica de Western blotting fue usada para determinar la inmunorreactividad de rCagA mediante el empleo de un antisuero de conejo específico Anti-CagA y un panel de sueros humanos CagApositivos y negativos.
Para insercion del gen se utilizo la técnica de electroporacion.
A mas de estos procedimientos se utilizaron otros métodos como purificacion del ADN plasmidico, electroforesis en gel de agarosa 8%, purificacion del vector.
Los resultados demostraron que el sistema de expresión empleado con 0,1mM de IPTG y 4 h de inducción produjo eficientemente el rCagA con la talla molecular esperada de aproximadamente 80kDa.
El objetivo de este experimento fue que la proteína CagA recombinante obtenida pueda ser utilizada para detectar y clasificar la infección con H. pylori por métodos serológicos.

http://revista.cnic.edu.cu/revistaCB/sites/default/files/articulos/CB-2010-4-CB-022.pdf

TÉCNICA DE PCR PARA EL DIAGNÓSTICO DE Helicobacter pylori

La reacción en cadena de la polimerasa es una herramienta biotecnológica muy útil para el diagnóstico de bacterias o virus de difícil cultivo in vitro como Helicobacter pylori que coloniza la parte superior del tracto gastrointestinal, su presencia por largos períodos está asociada con gastritis crónicas, úlceras pépticas y carcinomas gástricos. La PCR ha sido utilizada para detectar la presencia de H. pylori en muestras de biopsias gástricas, jugos gástricos, heces, saliva, placa subgingival, mediante fragmentos de genes de H. pylori que amplifican determinadas regiones de ADN.

El diagnóstico por PCR de H. pylori tiene una sensibilidad y especificidad de 95 % y su principal ventaja es que se puede detectar el microorganismo sin importar la viabilidad de la bacteria en las muestras.¹⁵ La especificidad de esta técnica viene dada por el uso de oligonucleótidos sintéticos, específicos para determinado gen y que facilitan la amplificación de una secuencia nucleotídica, que a su vez es específica para el H. pylori; es por esta razón que en los últimos años se ha diseñado una variedad de pruebas diagnósticas para esta bacteria por medio de PCR basándose en:

Oligonucleótidos provenientes del gen de la ureasa A (ureA).
Oligonucleótidos provenientes de los genes que codifican el 16s ARN ribosomal (16s rRNA).
Oligonucleótidos provenientes de los genes codificadores de los antígenos especie-específicos (SSA, cagA).
Oligonucleótidos provenientes de secuencias al azar (ramdon sequence).
Oligonucleótidos provenientes del gen de la fosfoglucosamin mutasa (glmM).

Oligonucleótidos que determinan variantes alélicas del gen vacA.

El gen del H. pylori cagA, el cual codifica a una proteína asociada con la producción de citotoxinas, está siendo utilizado como marcador de virulencia y puede ser fácilmente detectable por medio de reacciones de PCR, por lo que ofrece así otra ventaja a favor de las determinaciones moleculares.

Secuencia amplificada localizada en el gen	Tamaño del producto de PCR	Secuencia del oligonucleótido sintético	Referencia
Gen ureasa A	411pb	5´GCC AAT GGT AAA TTA GTT3´ 5´CTC CTT AAT TGT TTT TAC3´	40
Gen ureasa C	294 pb	5´AAG CTT TTA GGG GTG TTA GGG GTT T3´ 5´AAG CTT ACT TTC TAA CAC TAA CGC3´	41
Gen proteína 26 kDa	588 pb	5´ATG TTA GTT ACA AAA CTT3´ 5´AAT TTA ATT TTC TTT AAG3´	40
Gen proteína 26 kDa	298 pb	5´TGG CGT GTC TAT TGA CAG CGA GC3´ 5´CCT GCT GGG CAT ACT TCA CCA TG3´	42,43
Gen 16S rRNA	446pb	5´CTG GAG AGA CTA AGC CCT CC3´ 5´AGG ATG AAG GTT TAA GGA TT3´	12
Gen 16S rRNA	500pb	5´TGG CAA TCA GCG TCA GGT AAT G3´ 5´GCT AAG AGA TCA GCC TAT GTC C3´	44
Secuencia Random	207 pb	5´TAA CAA ACC GAT AAT GGC GC3´ 5´CAT CTT GTT AGA GGG ATT GG3´	2
Fragmento de ADN 0,86 Kb	417 pb	5´CCC TCA CGC CAT CAG TCC CAA AAA3´ 5´AAG AAG TCA AAA ACG CCC CAA AAC3´	13
vacA s1a vacA s1b vacA s2 vacA m1 vacA m2	190 pb 187 pb 199 pb 290 pb 352 pb	5`GTC AGC ATC ACA CCG CAA C3` 5`CTG CTG GAA TGC GCC AAA C3` 5`AGC GCC ATA CCG CAA GAG3` 5`CTG CTG GAA TGC GCC AAA C3` 5`GCT AAC ACG GGA AAT GAT CC3` 5`CTG CTG GAA TGC GCC AAA C3` 5`GGT CAA AAT GCG GTC ATG G3` 5`CCA TTG GTA CCT GTA GAA AC3` 5`GGA GCC CCA GGA AAC ATT G3` 5`CAT AAC TAG CGC CTT GCA C3` http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S0375-07602004000200001&script=sci_arttext	24  24  24  24  24

PRUEBA DE TAMIZAJE Y CONFIRMACION PARA EL CÁNCER DE ESTÓMAGO

El objetivo del tamizaje es la disminucion de incidencia y probabilidad de morir al adquirir cáncer gástrico, por lo que el paciente tamizado no debe ser menor a 5 años.
La población blanco en los estudios de tamización debe ser asintomática con un riesgo promedio de cáncer gástrico. Cuando se realiza un programa de tamización, lo primero es delimitar la población a estudio a la que se debe realizar un muestreo, para lo cual existen diferentes métodos, y solo se aplica a pacientes asintomáticos; las características de las pruebas de tamización son las siguientes: debe ser altamente sensible, fácil de aplicar, no invasiva y poco costosa.
Dentro de las consideradas pruebas de tamizaje encontramos a las siguientes:

1. La fotofluorografía con un nivel de evidencia 1++: Los estudios de casos y controles se realizó en Venezuela y los otros en Japón: estos mostraron una disminución del 40-60% en la mortalidad por cáncer gástrico al usar la fotofluoroscopia. La sensibilidad de la fotofluoroscopia estuvo entre 60-80% y la especificidad entre 80-90%. Solo se reportan como efectos adversos de su uso la exposición a radiación, la cual es ínfima.

2. Endoscopia (Nivel de evidencia 2): No hay estudio que evalúe la eficacia de la tamización con endoscopia en Japón; existe un estudio chino que no presentó cambios en la mortalidad. Solo hay dos estudios que reportan la precisión de la endoscopia como prueba diagnóstica (no para tamización), ya que la población tenía dispepsia y diversos síntomas gastrointestinales; no hay datos de mortalidad entre los pacientes tamizados y no se reportan efectos secundarios de la endoscopia como prueba de tamización.

3. Pepsinógeno sérico (Nivel de evidencia 2) Los datos son de baja calidad y no hay evidencia suficiente para su uso fuera del diagnóstico de gastritis atrófico, 

4. Anticuerpos para H. pylori (Nivel de evidencia 2): En combinación con pepsinógeno. 
5.- Pruebas con bario.
6.- Pruebas con marcadores tumorales CA19-9.



BIBLIOGRAFÍA: Tamización de cáncer gástrico: ¿es la endoscopia la mejor elección?.
 Rev Col Gastroenterol [online]. 2010, vol.25, n.1, pp. 7-9. ISSN 0120-9957.

MicroRNA interferentes relacionados con el cáncer de estómago.

Los microRNAs son RNA pequeños de 22 nucleótidos de longitud que participan en la regulación de algunos procesos celulares, al alterarse estos podrían generar cáncer ,se hallan localizados en sitios frágiles y regiones genómicas asociadas al cáncer  por lo que pueden sufrir delecciones, traslocaciones o amplificaciones que median procesos de tumorogénesis como la inflamación, regulación del ciclo celular, respuesta al estrés, diferenciación, apoptosis e invasión .
Estos microRNAs actúan como oncogenes y genes supresores de tumor que en el caso de los oncogenes se activan a protooncogenes y en el caso de los genes supresores se inactivan permitiendo la formación de cáncer.
Así también, muchos microARNs están asociados con la desregulación de ellos mismos y el desarrollo de cáncer; como es el caso de la familia del miARN let-7 está asociada con cáncer gástrico.

Tomado de:

Pabón-Martínez, Y. Vladimir. (2011). MicroARNs: una visión molecular. Revista de la Universidad Industrial de Santander. Salud, 43(3), 289-297. Retrieved November 08, 2015, from http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0121-08072011000300010&lng=en&tlng=pt. .

ALTERACIONES DE LA EPIGENÉTICA EN EL CÁNCER GÁSTRICO

La carcinogénesis gástrica involucra alteraciones genéticas y epigenéticas, éstas últimas causan alteraciones en la función génica sin modificación de la secuencia nucleotídica del ADN, el cambio epigenético mas frecuente en tumores malignos es la metilacion del ADN ya que incide sobre la inactivación de genes supresores de tumores, genes reguladores del ciclo celular, genes reparadores del ADN y genes involucrados en la invasión y metástasis. Ademas la metilación esta involucrada en la regulación transcripcional de genes durante la embriogénesis y en la inactivación del cromosoma X3.
La hipermetilación en regiones ricas en citocinas y guaninas y que se encuentran ubicadas frecuentemente cerca o dentro de áreas promotoras génicas produce represión transcripcional por un cambio en la estructura de la cromatina que la hace inaccesible a los factores de transcripcion, inactivando a los genes involucrados en las diferentes vías carcinogenéticas.
La región promotora de los genes que tienen mayor incidencia de afectación alcanzaron altos porcentajes en la frecuencia de metilación, como se puede observar en la siguiente tabla.


Tomado de: http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=S0034-98872005000800002&script=sci_arttext&tlng=pt